迷走神经在CVB3诱导小鼠急性心肌炎CD

文章来源:肥厚性心肌病   发布时间:2021-11-21 14:09:15   点击数:
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VagusnerveplaysapivotalroleinCD4+TcelldifferentiationduringCVB3-inducedmurineacutemyocarditis

病毒性心肌炎(VMC)可引起非特异性心肌间质炎症和坏死,导致年轻患者恶性心律失常、心力衰竭,甚至心源性猝死。VMC的发展可分为三个阶段。首先,病毒进入心肌细胞引起心肌损伤,并诱导宿主的固有免疫系统清除病原体。第二阶段的特点是适应性免疫和自身免疫反应。在这一阶段,T细胞、细胞因子和抗体的激活开始针对正常器官,从而加重心脏损伤并损害收缩功能。在第三阶段,心肌中持续存在的自身免疫过程可导致心肌重塑,并导致扩张型心肌病的发展。目前对VMC的研究主要集中在后两个阶段。CD4+T细胞,也称为Th细胞,在这些阶段被认为在介导免疫反应中起着关键作用。一些研究报道,CD4基因敲除的心肌炎小鼠的炎症反应显著减少。最近,Th细胞亚群(包括Th1、Th2、Th17和Treg细胞)在心肌炎的发病机制中表现出不同的甚至相反的作用。Huber等人发现雄性小鼠比雌性小鼠更容易受到柯萨奇B3病毒(CVB3)感染引起的VMC的影响。雄性小鼠对CVB3的免疫应答主要由Th1细胞介导,而雌性小鼠通过Th2细胞介导VMC免疫应答。有趣的是,移植了雌性小鼠Th2细胞的雄性VMC小鼠的心肌炎发展受到明显抑制。Fairwearher和同事报道Th1反应增加了急性炎症,然而这种反应通过抑制病毒复制和Th2反应来保护CVB3心肌炎。Th2反应通过抑制炎症减轻CVB3心肌炎,但可以通过刺激心脏重塑促进扩张型心肌病的进展。许多研究表明,Th17细胞及其细胞因子促进心肌炎的发展。相反,Treg细胞对心肌炎具有强大的抗炎作用,维持Th17和Treg细胞之间的平衡在小鼠和人类心肌炎中至关重要。在不同的心肌炎模型中,急性心肌炎的高峰时间点不同,单纯CVB3模型为D7,混合CVB3模型为D10,实验性自身免疫性心肌炎为D21。在VMC的发病机制中,多种细胞因子被激活,这些细胞因子与Th细胞亚群的分化密切相关。

伴有交感神经激活和迷走神经退缩的自主神经系统功能障碍有助于VMC的进展。先前的研究表明,过度的交感神经激活会上调炎症细胞因子的水平,从而加重炎症病变,而非选择性β受体阻滞剂卡维地洛则减轻了炎症反应。迷走神经参与控制心率和激素分泌,也是一种免疫调节剂。胆碱能抗炎途径(CAP)由迷走神经介导,迷走神经是支配大多数外周器官的最长颅神经,依赖α7-烟碱乙酰胆碱受体(α7nAChR)减轻炎症反应并修复VMC引起的免疫损伤。CAP的信号传递和激活依赖于迷走神经,α7nAChR与配体结合,调节信号通路,调节炎症。激活迷走神经的传出纤维通过CAP调节全身和局部炎症反应。以前的研究表明,α7nAChR激动剂尼古丁激活CAP可减轻炎症反应,右颈迷走神经切断术通过抑制CAP加重VMC。然而,迷走神经对VMC小鼠CD4+T细胞分化的影响尚未见报道。因此,在本研究中,我们检测了迷走神经对CD4+T细胞亚群分化的潜在影响。此外,我们还研究了颈迷走神经切断术对感染CVB3的小鼠心肌炎模型的影响。最后,我们研究了活化或抑制CD4+T细胞α7nAChR后Th细胞分化的潜在机制。

超声心动图表现

迷走神经切断后,除对照组外,其余小鼠均感染CVB3。从病毒接种后24小时开始,将pnu连续给予VMC小鼠14天。在第7天和第14天,对每组8只以上的小鼠进行超声心动图检查。来自VMC、VMC+Sham、VMC+Vag和VMC+V+P组的M型图像显示左心室运动弱于对照组和VMC+Pnu组。VMC、VMC+Sham、VMC+Vag、VMC+V+P和VMC+Pnu组的LVEF和FS与对照组相比显著降低,但LVESd略有升高。d14时,VMC+Vag组小鼠LVEF和FS降低,LVESd升高。VMC+Vag组给予pnu后,迷走神经切断损伤减轻。与VMC组相比,pnu能显著改善VMC+Pnu组的LVEF和LVFS,但降低LVESd。VMC组和VMC+Sham组的LVEDd、LVESd、LVEF和FS测量结果相似。

病毒在心脏的复制

我们检测了感染心脏组织中CVB3-RNA丰度的水平。d7时,VMC+Vag组CVB3-RNA丰度明显低于VMC组和VMC+Sham组。Pnu可增加VMC+Pnu组CVB3复制。d14时各组间无显著性差异。此外,与第7天相比,第14天心肌中的病毒复制水平降低。

心肌组织病理学

我们通过HE染色检查了心肌组织病理学的变化。对照组第7天和第14天均无明显病理改变,VMC组和VMC+Sham组损伤严重,伴有细胞浸润和坏死。迷走神经切断加重VMC小鼠细胞浸润和坏死程度。pnu可显著减轻VMC+Vag小鼠的病理损伤。同样,在VMC小鼠中施用pnu表现出更小和更有限的细胞浸润和坏死病灶

d7和d14心脏促炎细胞因子的表达

为了评价迷走神经对心脏促炎细胞因子的影响,我们通过westernblot检测IL-6、IL-1β和TNF-α的表达。与对照组相比,在第7天,VMC组的IL-1β、IL-6和TNF-α水平分别显著升高1.54、1.87和3.07倍,VMC+假手术组分别升高1.46、1.83和3.03倍。迷走神经切断术后VMC+Vag组IL-1β、IL-6和TNF-α的释放分别是VMC组的1.43、1.28和1.40倍。然而,pnu给药使VMC小鼠的促炎细胞因子产生减少了0.68-、0.67-、0.53倍,VMC+Vag小鼠的促炎细胞因子产生减少了0.68-、0.74-、0.70倍(p0.05)。d14时5个心肌炎组间IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平无显著性差异。

第7天和第14天心脏Th细胞亚群中特异性转录因子和细胞因子的水平

T-bet、Gata3、Ror-γ和Foxp3分别是在Th1、Th2、Th17和Treg细胞中发现的特异性转录因子。IFN-γ、IL-4和IL-17分别是Th1、Th2和Th17细胞的特异性细胞因子。因此,我们观察了Th1、Th2、Th17和Treg细胞的比例变化,以及特定转录因子和细胞因子的表达变化。迷走神经切断阻断CAP可显著降低第7天VMC小鼠心脏中Th2细胞相关Gata3和IL-4以及Treg细胞相关Foxp3的蛋白表达,并升高Th17细胞相关Ror-γ和IL-17以及Th1细胞相关T-bet和IFN-γ的水平。相反,pnu治疗产生相反的效果,VMC+Pnu和VMC+V+P组与VMC和VMC+Vag组相比,Gata3、Foxp3和IL-4的表达增加,T-bet、Ror-γ、IFN-γ和IL-17的表达降低。还检测了Th细胞特异性转录因子的mRNA水平,并且结果与Westernblot分析的结果一致。d14时,5个心肌炎组Th细胞亚群特异性转录因子和细胞因子表达无明显差异

体内脾脏Th亚群百分率

采用流式细胞术检测脾脏CD4+T细胞亚群的百分率。迷走神经切断后d7,VMC小鼠IFN-γ+CD4+Th1和IL-17+CD4+Th17细胞百分率升高,IL-4+CD4+Th2和CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分率降低。而pnu可使VMC小鼠Th1、Th17细胞百分率下调,Th2、Treg细胞百分率上调。此外,pnu部分缓解了VMC+Vag小鼠中Th亚群的百分比变化

体内脾CD4+T细胞JAK2-STAT3和NF-κB信号通路的蛋白表达

基于以上结果,通过迷走神经切断或pnu抑制或激活CAP可调节Th细胞亚群的分化,但其发生的潜在机制尚不清楚。NF-κB信号通路对免疫细胞的激活和炎症细胞因子的形成至关重要。JAK-STAT信号通路受到在细胞增殖、分化、迁移和凋亡中起关键作用的介质的刺激。因此,我们检测了d7小鼠脾CD4+T细胞中JAK2-STAT3和NF-κB信号通路的蛋白水平。迷走神经切断介导的CAP抑制抑制VMC小鼠脾CD4+T细胞中JAK2和STAT3的磷酸化,增强NF-κBp65和IκB的磷酸化(p0.05)。Pnu治疗组与VMC+Pnu组作用相反,逆转了VMC小鼠迷走神经切断术的作用

体外培养脾CD4+T细胞中JAK2-STAT3和NF-κB信号通路的蛋白表达

为了更准确地探讨Th细胞的分化机制,我们在d7上分离培养了CVB3诱导的小鼠脾CD4+T细胞。α7nAChR激动剂Pnu和α7nAChR拮抗剂MLA用于主动和阻断CAP。体外实验采用MLA代替迷走神经切断术。用选择性NF-κB抑制剂PDTC和STAT3抑制剂NSC检测信号通路的影响。根据各组,用不同的处理方法培养CD4+T细胞5d,MLA组p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3的磷酸化蛋白表达率分别降低了0.35倍和0.38倍,p-P65/P65和p-IκB-α/IκB-α的磷酸化率分别提高了1.39倍和1.78倍与PBS组比较(p0.05)。Pnu组p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3的磷酸化蛋白表达率明显高于PBS组(p0.05),p-P65/P65和p-IκB-α/IκB-α的磷酸化率明显低于PBS组(p0.05)。这些结果与体内结果相似。此外,给予PDTC可显著降低Pnu组和MLA组NF-κBp65和IκB的磷酸化,而给予NSC可分别降低Pnu组和MLA组STAT3的磷酸化和JAK2的磷酸化(Pnu+PDTC对Pnu,MLA+PDTC对MLA,Pnu+NSC对Pnu,MLA+NSC对MLA,p0.05)。

体外培养脾CD4+T细胞的分化

T-bet、Gata3、Ror-γ和Foxp3分别是Th1、Th2、Th17和Treg细胞的特异性转录因子。因此,我们检测了体外培养的脾脏CD4+T细胞中特异性转录因子的蛋白表达水平。Pnu组Gata3和Foxp3蛋白表达分别增加1.54倍和1.69倍,而T-bet和Ror-γ表达分别减少0.73倍和0.68倍(p0.05)。然而,与PBS组相比,MLA组Gata3和Foxp3表达分别下调0.80倍和0.65倍,而T-bet和Ror-γ表达上调1.62倍和1.44倍(p0.05)。此外,通过给予PDTC抑制NF-κB通路可降低Pnu或MLA组中T-bet和Ror-γ的表达,而通过给予NSC抑制STAT3通路可分别降低Gata3和Foxp3的表达(Pnu+PDTC与Pnu,MLA+PDTC与MLA,Pnu+NSC与Pnu,MLA+NSC与MLA,p0.05。

体外培养脾CD4+T细胞的百分率

第5天,检测CVB3诱导的小鼠CD4+T细胞中Th亚群的百分率。Pnu组Th1和Th17细胞百分比低于PBS组,MLA组高于PBS组(p0.05)。Pnu组Th2和Treg细胞百分率高于PBS组,MLA组低于PBS组(p0.05)。抑制NF-κB通路可降低Pnu组和MLA组Th1和Th17细胞的比例,而抑制STAT3通路可分别降低Pnu组和MLA组Th2和Treg细胞的比例(Pnu+PDTC对Pnu,MLA+PDTC对MLA,Pnu+NSC对Pnu,MLA+NSC对MLA,p0.05)。

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